カテゴリ:論文( 36 )

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Nature 460, 632-636 (30 July 2009)
Presenilins are essential for regulating neurotransmitter release

プレセニリン変異は家族性アルツハイマー病の主な原因で、プレセニリン活性の欠損やアミロイドβの蓄積がシナプスを傷害し、アルツハイマー病理につながると考えられている。
しかし具体的にどうシナプス障害が起こるのかよくわかっていなかった。

筆者らは遺伝学的に前シナプス(CA3)あるいは後シナプス(CA1)の神経細胞においてコンディショナルにプレセニリンを不活性化した。すると前シナプスでプレセニリンを欠落させた場合にのみLTP減少、シナプス可塑性も変化。
open-channel NMDA (N-methyl-d-aspartate) 受容体のアンタゴニストである MK-801を使ってグルタミン酸の放出を測定→前シナプスでプレセニリン不活性化のときのみ減少。
ほかにも、ER内Ca2+貯蓄をなくすthapsigarginや、貯蓄からの放出を阻害するリアノジン受容体阻害剤などで、前シナプスプレセニリン不活性化と似たような現象が起きた。

つまりプレセニリンは何をしているのかというと、「前シナプスで細胞内Ca2+放出をmodulate→活性依存的な神経伝達物質の放出の制御」ということのようです。
筆者らはアルツハイマー病の早期の病理として、前シナプスの障害があるのではないかと言っていました。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-07-31 20:23 | 論文

読み会

夕刻ぼーっと外を見ていると、やがて陽が沈み、すると急に空に赤みが消え、あたりがいちめん藍色になる瞬間がある。そのあとは真っ暗になっていくだけなんですが、なにもかもが海の底に沈んでしまったかのような、そんな30分くらいの時間帯が好きです。

Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes
Cell, Volume 79, Issue 6, 957-970, 16 December 1994

Requirement for the Homeobox Gene Hb9 in the Consolidation of Motor Neuron Identity
Neuron, Volume 23, Issue 4, 659-674, 1 August 1999

「運動ニューロンのアイデンティティ確立にはHb9が必要」
基本的にはHb9ノックアウトマウスの解析。
MNのpopulationを細かく検討した結果、Hb9ノックアウトマウスではHb9を発現しているはずのMNがV2 interneuron様のmolecular featureを獲得していた(=fate conversion)
しかもこれらのニューロンは脊髄から出て、肋間では一部がBTXとmergeしていた(ただし異常な架橋構造などあり)
横隔膜では既報どおりニューロンは来てない
ということでHb9が失われたMNは「MNではない、なにか」になってしまっているらしい。ちょっと怖い。

A novel role for embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at the neuromuscular junction
J. Biol. Chem, 10.1074/jbc.M809491200

「embiginの新たな機能:NMJで運動ニューロン終末のsproutingを促進する」
背景として、いちど神経を取り去った筋肉ではNMJ形成のためのさまざまなタンパクを合成するらしく、foreignな神経終末が来てもそれを受け入れてNMJ形成してしまうらしい。
このとき、具体的にどんなタンパクが合成されてるのか?を調べるべくinnervation時/denervation時のmRNAを比較し、その発現レベルに差があるヤツをスクリーニング→候補にembigin
(NCAM様の構造をもっているらしく、それも候補にあがった理由のひとつ)
embiginは一回膜貫通型の構造をとっていて、細胞内ドメインがシグナル伝達にかかわるだろうと考えられている。
そこでembigin全長の過剰発現マウスと細胞内ドメインを欠いたembigin過剰発現マウスを作出、解析
→前者では終末のsproutingが起こり、後者では起こらなかった
→siRNAのノックダウンにより終末のretractionが起こる、NCAM-/-で増悪
まとめとして、embiginはNCAMのmuscle-nerve間接着を増強させていると。


また助教から仕事が降りてきたのでとうぶん忙しくなりそうです。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-06-10 23:51 | 論文

シュワン細胞分化の下流シグナル

UNIQLOCKを導入した。
ユニクロ大好きですから。


Calcineurin/NFAT Signaling Is Required for Neuregulin-Regulated Schwann Cell Differentiation
Science 30 January 2009:
Vol. 323. no. 5914, pp. 651 - 654
「Calcineurin/NFATシグナリングがシュワン細胞の分化に必要」

今までに知られていた事実;
・NRGやErbBのノックアウトマウスでシュワン細胞が死んでいることから、NRG→ErbBでシュワン細胞の増殖とか生存が調節されているようだ
・Ca influx上昇→Calcineurin (=phosphatase)→NFATのリン酸化解除→NFATが核内に移行・転写制御
①CalcineurinのB1サブユニット (CnB1)をneural crestで落とした(wnt creマウスとのかけ合わせ)マウスを作出
→DRG cocultureにおいてCnB1のphosphatase活性が失われた(NFATのリン酸化解除されず)
→さらに神経をみるとaxon/bundleの比率が落ちる
→myelinationにかかわるタンパクのレベル落ちる
→シュワン細胞自体の生存は正常レベル
→nestin creだとこれらの異常は見られない
ということでシュワン細胞のcell autonomousな影響で、myelinationに障害が出ている
②転写制御をくわしく
NRG刺激によりNFAT promoterが動く(レポーターアッセイ)
さらにNFATのnuclear partnerを探した→Sox10だ!(affinity column→MS)
NRG刺激によるKrox20 MSEの活性上昇がSox10共存によりさらに高くなる(=シナジー効果)、しかもP0 promoterも動く→direct/indirectな調節機構があるっぽい
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by 5-gekkostate-3 | 2009-06-09 22:59 | 論文

読み会

Nat Neurosci. 2007 May;10(5):615-22. Epub 2007 Apr 15
Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons.

ALSは運動ニューロンが死んで、最終的に呼吸困難などで死亡する難病。
家族性ALSの原因のひとつSOD1変異は、どの細胞で、どのように悪さをしているのか。これをvitroで調べた。
Jessell博士の「運動ニューロンが光る」Hb9GFP tgマウスを用い、
脊髄由来のprimary MN (PMN)、ES細胞由来のMN (ESMN)で検討。
MNそのものに変異を入れても細胞が小さいなど、mildな変化しか起こらない。
ところがastrocyteに変異を入れて、MNとcocultureすると生存率がぐっと下がる。
astrocyteそのものではなく、その培養上清をMNにかけても生存率が下がる。
この毒性はMN特異的で、interneuronなどの生存率は下がらない。
さいごに、MNの細胞死はBaxのinhibitorで抑制できる→caspase dependentなアポトーシスか?
という感じ。


Nature 410, 1057-1064 (26 April 2001)
Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse
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by 5-gekkostate-3 | 2009-06-03 23:51 | 論文

当日はすらすら書ける

Mくん
C2C12とMNに分化させたES細胞を仕切りに分けて培養、その後仕切りを取り去る→神経がc2c12に向けて軸策を伸ばし、NMJ形成、筋肉の収縮が見られた。(じっさいに収縮している映像があった。気持ち悪かった)
これを脊損の患者さんの脊髄に移植すれば治療できるかもしれない。
問題は、脊髄に移植したMNがaxonを伸ばさないこと。
これにはmyelinが関係しているようだ。(阻害剤の投与→伸長)

Oくん
先週にひきつづきintegrin b1 を神経・筋肉それぞれ特異的にノックアウトしたconditional knockout mouse (cKO mouse)のphenotype解析。
まずはnestin creとの交配によるnestin Itgb1 cKO mouseの解析から。
MN axonの到達やAChR cluster, Itgb1以外のbasal lamina 構成因子、GFAP (Schwann), Synaptophysin (pre)も正常。→ようは異常なし。
つづいてHSA Itgb1 cKOの解析。
こちらは発生が進むにつれ異常が顕著に。
axonはAChRをスルーして伸び放題。
AChR clusterもどうやらmicro clusterのまま。
in vitroでも、agrin投与によるAChR cluster形成が弱い。

助教
JN最新号。
IBMという病気があるらしい。知らなかった。
これは老年性の病気で、筋肉にAβ (とくにAβ42)が蓄積することが知られ、症状はたしか運動障害。
いわば「筋肉のアルツハイマー病」。
これをアルツハイマー病同様、passive immunizationで治療しようという方針。
いきなり人間でやるのはまずいので、まずはモデルマウスでの検討。
モデルマウスはさまざまだが、今回使ったのはc100過剰発現マウスとγ secretaseに変異が入っているマウスを掛け合わせたマウス。
これによって全身にAβ42が大量に産生することになり、じっさいのIBMと同様の所見を得た。
たしかAβ-MAPというAβの塊を注射して抗体をつくらせる。
この技術をつかって同様にIBMモデルマウスに免疫すると、IBM様の症状が有意に回復した。
あとoligomerで悪化。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-05-20 21:14 | 論文

読み会

Oくん「みんなでこれから飲み会に行くのかと思いました」

JN 24 8181- (2004)

Cell 110 385- (2005)

Neuron 52 293- (2006)
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by 5-gekkostate-3 | 2009-05-19 09:41 | 論文

読み会

自分 collagen XVIIIとLH3のglycosyltransferase活性について (Neuron 2006)
motor neuron (MN)伸長異常を示すdiwankaの原因遺伝子がlysyl hydroxylase (LH)3であることを解明
1.まわりのECMが悪いのか?
→diwankaではコラーゲン (col2)の局在がおかしくなる
→MN伸長のガイド役を果たすECMでは3層構造のうちコラーゲンだけが見当たらなかったが他は正常
2.MN伸長そのものが悪いのか?
→LH3の局在はMN伸長直前のadaxial cellにあった
→しかしLHファミリーのLH1, LH2も発現→LH3だけが持つユニークな機能?
→LH3だけがglycosyltransferaseをもち、これがあればdiwankaをレスキュー可能
→glycosyltransferaseの基質としてcollagen XVIIIがある
ということで後者なんじゃないかという主張。

Mくん (MCB ?)
ノックアウトマウスをつくるとき、相同組み換えを起こしてtarget alleleをヘテロにもつES細胞がもとになる。
しかしこのヘテロのES細胞を飼いつづけるとtarget alleleをホモにもつ細胞もできるらしい。

助教 いろんな論文から網羅的に。MN死について。
<逆行性の軸索輸送の障害は運動ニューロン死をひき起こす>
運動ニューロンにおいて逆行性の軸索輸送を担当する dynein/dynactin複合体の一方の要素であるdynactinのサブユニット、dynamitin tg mouse
→10ヶ月を過ぎた頃から特に下肢の筋力低下が目立ち始め、MNおよびMN axonの減少(Neuron 34:715-27, 2002).
ALSに類似した遺伝性の運動神経疾患を有するアラバマ州の大家族において dynactinのp150Glued subunitにミスセンス変異(G59S)の発見(Nat Genet 33; 455-456, 2003)
ただし、dynactin遺伝子変異がなぜ運動神経だけに影響を与えるのかは不明。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-05-11 22:54 | 論文

読み会

自分はMCB 2005から
AP-2 μ2サブユニットのノックアウトマウスはembryonic lethal (E3.5までも生きられない)
→cell survivalに必要だろう
一方へテロは元気。AP-2 complexのμ2サブユニットおよびαサブユニットでともにタンパク量が落ちているが半減とまでは行かない→complexが不安定になっている、なんらかの代償機構
CD63を用いたendocytosisの評価も野生型と変わらず。

Mくんは・・・なんだっけ
神経細胞の軸索におけるmRNAの分布をマイクロアレイで見た、という報告。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-04-30 22:46 | 論文

読み会

自分 Science 13 March 1998: Vol. 279. no. 5357, pp. 1725 - 1729
myo-GDNFマウスを作製。発現レベルの異なる複数ラインを確保。
NMJでhyperinnervationが起こる。neuron数、筋肉の本数は変わらない。
ただしsingle innervationになるのが遅れるだけ。

助教 CNTFにかんする古い論文
CNTFノックアウトマウスは元気で、若干のMN lossはあるものの野生型とたいして変わらない。
ところがCNTF-Rノックアウトマウスは母乳を飲めずに24時間以内に死亡。
原因は顎の筋肉が動かせないからだとか。
MN lossもたくさん起きている。
「CNTF以外のファクターがCNTF-Rを介してMN survivalに必須なシグナルを流すのでは?」というディスカッション。
CNTF-R自体はGPIアンカーで、LIFRとgp130といっしょにCNTF-R complexを形成する。
なので、下流を流すのはLIFR or gp130。どっちか忘れた。

MくんはCell
マウスneonatalの精巣由来の細胞をある条件下で培養しつづけるとES細胞っぽくなるという報告。
mRNAの発現プロファイル、methylation (acetylation?忘れた)具合がES細胞と似ている。
ES細胞と同様の操作で分化誘導に成功。
さらに母マウスに移してキメラ作製に成功。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-04-23 13:38 | 論文

HSP90β

読み会。内容はいずれもうろ覚え。

自分は昨年10月に出たNeuron論文から
http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081009111026.htm
にも紹介されてました。

「HSP90βはRapsynのturnoverを制御し、結果的にAChR cluster形成・維持も制御する」
αBTX pull down、MS解析→HSP90βがとれた
HSP90βはAChR clusterとcolocalize
HSP90β-Rapsyn-AChRaが結合
阻害剤、miRNA、dominant negativeでcluster減少(vitro, vivo)
CHX(シクロヘキシミド)投与下で阻害剤投与→rapsynが時間依存的に減少。


助教はNeuron1999?ふるい論文
NMJの維持にはBDNF-TrkBシグナルが効いている
TrkBには細胞外領域だけのsplice variantあり。SVはシグナリングに関与しない
免染→FLはclusterときっちり共存、SVは若干もやもや
SVをvirus infectionで筋肉に導入するとdominant negative効果→AChR clusterの「つぶつぶ」が増える
TrkB +/-マウスでも同様の所見。
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by 5-gekkostate-3 | 2009-04-15 22:13 | 論文

動物の社会性行動を研究中。実験の待ち時間に書きます。


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