ハエの研究はどんどん進みますね
Glial-Derived Prodegenerative Signaling in the Drosophila Neuromuscular System
ハイライト
→Drosophila NMJにおけるグリア由来のprodegenerative signalingの発見
→TNF-αは末梢のグリアに発現しており、neuromuscular degenerationに必要
→TNF-α受容体は運動ニューロンに発現しており、NMJ degenerationに必要
→ミトコンドリア依存的なシグナリングがprodegenerativeなメカニズムに働く
Summary
研究グループはDrosophilaのneuromuscular systemにおけるprodegenerative, glial-derived signalingを発見した。このシグナリングはcaspaseやミトコンドリア依存的なシグナリングを含む。
まず明らかにしたことは、Drosophila TNF-α (eiger) がperipheral gliaのsubsetに発現しており、
TNF-α receptor (TNFR), Wengen,が運動ニューロンに発現していること。
次にNMJ degeneration（spectrin/ankyrin 骨格を奪う？ことで惹起される）はperipheral gliaにおけるeiger変異体やeiger knockdownによって抑制される。さらに運動ニューロンにおけるwengen欠損によっても同様の抑制がみられたので、glia由来のprodegenerative TNF-α signalingの存在が示唆された。
JNK 、NFκβ のいずれもprodegenerative signalingに必要ではなかった。しかし、initiator caspaseであるDroncやeffetor caspaseであるDcp-1、ミトコンドリア依存的なシグナリングが関与していることを突き止めた。軸索や軸索末端にミトコンドリアがいないような変異体ではdegenerationが抑制され、これはDrosophila Bcl-2 (debcl, mitochondria-associated protein）や Apaf-1 (dark、ミトコンドリアシグナリングと他のシステムのcaspase活性とを結びつける）の変異体と同様であった。
ハイライト
→Drosophila NMJにおけるグリア由来のprodegenerative signalingの発見
→TNF-αは末梢のグリアに発現しており、neuromuscular degenerationに必要
→TNF-α受容体は運動ニューロンに発現しており、NMJ degenerationに必要
→ミトコンドリア依存的なシグナリングがprodegenerativeなメカニズムに働く
Summary
研究グループはDrosophilaのneuromuscular systemにおけるprodegenerative, glial-derived signalingを発見した。このシグナリングはcaspaseやミトコンドリア依存的なシグナリングを含む。
まず明らかにしたことは、Drosophila TNF-α (eiger) がperipheral gliaのsubsetに発現しており、
TNF-α receptor (TNFR), Wengen,が運動ニューロンに発現していること。
次にNMJ degeneration（spectrin/ankyrin 骨格を奪う？ことで惹起される）はperipheral gliaにおけるeiger変異体やeiger knockdownによって抑制される。さらに運動ニューロンにおけるwengen欠損によっても同様の抑制がみられたので、glia由来のprodegenerative TNF-α signalingの存在が示唆された。
JNK 、NFκβ のいずれもprodegenerative signalingに必要ではなかった。しかし、initiator caspaseであるDroncやeffetor caspaseであるDcp-1、ミトコンドリア依存的なシグナリングが関与していることを突き止めた。軸索や軸索末端にミトコンドリアがいないような変異体ではdegenerationが抑制され、これはDrosophila Bcl-2 (debcl, mitochondria-associated protein）や Apaf-1 (dark、ミトコンドリアシグナリングと他のシステムのcaspase活性とを結びつける）の変異体と同様であった。
分野違いではあるけれど
HSPG Modification by the Secreted Enzyme Notum Shapes the Wingless Morphogen Gradient
Antonio J. Giráldez, Richard R. Copley and Stephen M. Cohen*
分泌タンパクWinglessはDrosophilaのimaginal discのパターンを形成するmorphogenとして機能する。研究グループはWingless活性を抑制する新たな分泌タンパクNotumを同定した。
Notum機能欠損によりWingless活性は上昇し、このときWinglessタンパクの濃度勾配を変化させている。過剰発現すると、NotumはWingless活性をブロックする。Notumはα/β-hydrolase superfamilyのメンバーをコードしており、pectin acetylesterasesに近い.
さらにNotumは、HSPGであるDally-likeとDallyをmodifyすることでWinglessタンパクの分布に影響を与えることが明らかになった。また、Winglessシグナリングレベルが高いとNotum発現が誘導される。
これらのことから、Notumの発現を制御することで、Winglessは自身の濃度勾配を形作ることがわかった。
Antonio J. Giráldez, Richard R. Copley and Stephen M. Cohen*
分泌タンパクWinglessはDrosophilaのimaginal discのパターンを形成するmorphogenとして機能する。研究グループはWingless活性を抑制する新たな分泌タンパクNotumを同定した。
Notum機能欠損によりWingless活性は上昇し、このときWinglessタンパクの濃度勾配を変化させている。過剰発現すると、NotumはWingless活性をブロックする。Notumはα/β-hydrolase superfamilyのメンバーをコードしており、pectin acetylesterasesに近い.
さらにNotumは、HSPGであるDally-likeとDallyをmodifyすることでWinglessタンパクの分布に影響を与えることが明らかになった。また、Winglessシグナリングレベルが高いとNotum発現が誘導される。
これらのことから、Notumの発現を制御することで、Winglessは自身の濃度勾配を形作ることがわかった。
zebrafish, hspg
Assembly of Lamina-Specific Neuronal Connections by Slit Bound to Type IV Collagen
Tong Xiao1, Wendy Staub1, Estuardo Robles1, Nathan J. Gosse1, Gregory J. Cole2, Herwig Baier1, 3
脳における特定のニューロン結合メカニズムはこれまでに多くの研究がなされている。
ゼブラフィッシュでは、RGCの軸索は中脳tectum neuropil中の（最低）6層に投射する。
それぞれの軸索はtarget layerの１つに単一の平らなarborを形成しtectal neuronのdendriteとシナプスを形成する。
研究グループはretina-tectum結合の層特異性はRGC軸索でのself-sorting interactionに依存しないことを明らかにした。むしろ、tectum由来のSlit1が、軸索のRobo2を介してtarget layerにneuriteを誘導することがわかった。
さらに遺伝学的・生化学的研究によりSlitはIV型コラーゲンであるDragnet (Col4a5)と結合する。Dragnetはtectum表面の基底膜を形成する。
また研究グループはradial gliaのendfeetが、Slitを基底膜にアンカーするのに必要であることを明らかにした。
これらの結果から、Slit1 signalingは表面ー深部勾配を形成し、伸長しつつあるretinal axonに層状の位置情報を提示しているのではないか？といったことが示唆された。
Tong Xiao1, Wendy Staub1, Estuardo Robles1, Nathan J. Gosse1, Gregory J. Cole2, Herwig Baier1, 3
脳における特定のニューロン結合メカニズムはこれまでに多くの研究がなされている。
ゼブラフィッシュでは、RGCの軸索は中脳tectum neuropil中の（最低）6層に投射する。
それぞれの軸索はtarget layerの１つに単一の平らなarborを形成しtectal neuronのdendriteとシナプスを形成する。
研究グループはretina-tectum結合の層特異性はRGC軸索でのself-sorting interactionに依存しないことを明らかにした。むしろ、tectum由来のSlit1が、軸索のRobo2を介してtarget layerにneuriteを誘導することがわかった。
さらに遺伝学的・生化学的研究によりSlitはIV型コラーゲンであるDragnet (Col4a5)と結合する。Dragnetはtectum表面の基底膜を形成する。
また研究グループはradial gliaのendfeetが、Slitを基底膜にアンカーするのに必要であることを明らかにした。
これらの結果から、Slit1 signalingは表面ー深部勾配を形成し、伸長しつつあるretinal axonに層状の位置情報を提示しているのではないか？といったことが示唆された。
線虫モデル
Axon Regeneration Pathways Identified
by Systematic Genetic Screening in C. elegans
Neuron, 2011
神経軸索が損傷後ふたたび伸長するメカニズムを分子遺伝学的に説明する知見はほとんどない。研究グループは線虫機械受容ニューロンでのレーザー損傷モデルを用い軸索再生を制御する654の遺伝子をスクリーンした。
そこでこのグループは軸索再生を促進したり抑制したりする機能的なgene clusterをみつけた。
そのなかには、axon guidanceに影響をおよぼすことが知られているもの、membrane excitability (?), neurotransmission, synaptic vesicle endocytosisに関わるものなどが含まれていた。Arf Guanine nucletide Exchange Factor (GEF), EFA-6は軸索のregrowthを抑制する。
遺伝学とin vivo imagingを組み合わせて、EFA-6はmicrotubule dynamicsを介してregrowthを抑制することを示し、しかもこれはArfのGEF活性に依存しないことが明らかになった。
あらたに同定されたregrowth inhibitorの中で、EFA-6の機能欠損のみがDLK-1 kinase必要性 (?)を回避した。
このようなpathwayの同定によって、軸索損傷の反応や修復の遺伝学的な基礎の理解が深まるだろう。
by Systematic Genetic Screening in C. elegans
Neuron, 2011
神経軸索が損傷後ふたたび伸長するメカニズムを分子遺伝学的に説明する知見はほとんどない。研究グループは線虫機械受容ニューロンでのレーザー損傷モデルを用い軸索再生を制御する654の遺伝子をスクリーンした。
そこでこのグループは軸索再生を促進したり抑制したりする機能的なgene clusterをみつけた。
そのなかには、axon guidanceに影響をおよぼすことが知られているもの、membrane excitability (?), neurotransmission, synaptic vesicle endocytosisに関わるものなどが含まれていた。Arf Guanine nucletide Exchange Factor (GEF), EFA-6は軸索のregrowthを抑制する。
遺伝学とin vivo imagingを組み合わせて、EFA-6はmicrotubule dynamicsを介してregrowthを抑制することを示し、しかもこれはArfのGEF活性に依存しないことが明らかになった。
あらたに同定されたregrowth inhibitorの中で、EFA-6の機能欠損のみがDLK-1 kinase必要性 (?)を回避した。
このようなpathwayの同定によって、軸索損傷の反応や修復の遺伝学的な基礎の理解が深まるだろう。
ハエHSPG
Cell Type-Specific Requirements for Heparan Sulfate Biosynthesis at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects on Synapse Function, Membrane Trafficking, and Mitochondrial Localization
The Journal of Neuroscience, 1 July 2009, 29(26): 8539-8550
Drosophilaを含むあらゆる種において、HSPGはneuromuscular synapseに蓄積している。
研究グループはheparan sulfate合成やsulfationをブロックするDrosophila変異体を用いることで、neuromuscular junctionにおけるHSPGの生理機能を明らかにした。
作出された変異体ではシナプスの生理学的・形態的異常が見られたことから、HSPGはpresynaptic・postsynaptic両方で機能することが示唆された（これらの異常は適切なtransgene発現によってレスキューされた）。
特に興味深かった点が、ミトコンドリア局在の異常、骨格筋におけるGolgiやER marker分布の異常、運動ニューロンにおける刺激依存的なendocytosisレベルの上昇である。
これらのデータから、HSPGの機能は細胞表面やmatrix環境に限ったものではなく、membrane trafficking やオルガネラ分布などの広範なcellular processにも及んでいることが考えられる。
The Journal of Neuroscience, 1 July 2009, 29(26): 8539-8550
Drosophilaを含むあらゆる種において、HSPGはneuromuscular synapseに蓄積している。
研究グループはheparan sulfate合成やsulfationをブロックするDrosophila変異体を用いることで、neuromuscular junctionにおけるHSPGの生理機能を明らかにした。
作出された変異体ではシナプスの生理学的・形態的異常が見られたことから、HSPGはpresynaptic・postsynaptic両方で機能することが示唆された（これらの異常は適切なtransgene発現によってレスキューされた）。
特に興味深かった点が、ミトコンドリア局在の異常、骨格筋におけるGolgiやER marker分布の異常、運動ニューロンにおける刺激依存的なendocytosisレベルの上昇である。
これらのデータから、HSPGの機能は細胞表面やmatrix環境に限ったものではなく、membrane trafficking やオルガネラ分布などの広範なcellular processにも及んでいることが考えられる。
筋細胞の転写因子
Nfix Regulates Fetal-Specific Transcription in Developing Skeletal Muscle
Volume 140, Issue 4, 19 February 2010, Pages 554-566
Skeletal myogenesis（骨格筋の出来かた）は２段階になっていて、最初期にはembryonic、そのあとfetalができるといわれている。それぞれの筋細胞は異なる細胞種で、異なる遺伝子を発現している。（同じ筋細胞でも途中から別物に変わるというのが面白い）。このひとたちはtranscription factor nuclear factor one X (Nfix)という転写因子がPax7によって活性化して、fetalの遺伝子プロファイルを発現させて（ON）、これまでのembryonicなプロファイルを抑制する（OFF）するスイッチ的な役割を果たすことを見つけた。
※
fetal...MCK and β-enolase
embryonic...slow myosin
MCK promoterにかんしては、NfixはPKC θとcomplexを形成し、MEF2Aと結合しリン酸化し活性化する。たとえば、embryonicな筋細胞にNfixを強制的に発現させるとfetal様になり、fetalに特徴的な遺伝子プロファイルを発現するようになる、など。culture系だけでなく、個体でも見ている。
単純な話だけどきれいな証明なのでcellに載せられたんでしょうか。いいなあ。
Volume 140, Issue 4, 19 February 2010, Pages 554-566
Skeletal myogenesis（骨格筋の出来かた）は２段階になっていて、最初期にはembryonic、そのあとfetalができるといわれている。それぞれの筋細胞は異なる細胞種で、異なる遺伝子を発現している。（同じ筋細胞でも途中から別物に変わるというのが面白い）。このひとたちはtranscription factor nuclear factor one X (Nfix)という転写因子がPax7によって活性化して、fetalの遺伝子プロファイルを発現させて（ON）、これまでのembryonicなプロファイルを抑制する（OFF）するスイッチ的な役割を果たすことを見つけた。
※
fetal...MCK and β-enolase
embryonic...slow myosin
MCK promoterにかんしては、NfixはPKC θとcomplexを形成し、MEF2Aと結合しリン酸化し活性化する。たとえば、embryonicな筋細胞にNfixを強制的に発現させるとfetal様になり、fetalに特徴的な遺伝子プロファイルを発現するようになる、など。culture系だけでなく、個体でも見ている。
単純な話だけどきれいな証明なのでcellに載せられたんでしょうか。いいなあ。
水曜日
実験はどれもうまくいかず胃が痛くなってしまった。
帰宅して風呂にゆっくり浸かり、ヨーグルトをたべたらすっかり元気です。
今日はOと助教の論文読み会がありました。
Oは神経栄養因子の軸索末端からの取り込みについて。
BDNFと受容体のTrkBは結合して、軸索を介して生存シグナルが輸送されることが知られていますが、BDNFに巨大なビーズをつけ、とりこめないようにした実験で、TrkBが単体で生存シグナルを輸送しうることは照明されました。でも生理的な条件下で、複合体を形成して輸送されているのか、この論文からではわからなかった。
自分はES細胞から単一のneuronal progenitor cellをつくってneuronに分化させたという報告と、それを利用したaxon degenerationモデル、またaxonal degenerationをひきおこす分子の探索。
galectin-1という分子をみつけて検討していました。
助教は神経栄養因子シグナリングが脳においてどの時期に依存しているかの報告。
BDNFノックアウトマウスはふつう生後すぐ死亡してしまうが、まれに数日間生きる個体がいて、それを用いた脳での検討。脳でもアポトーシスによって神経細胞が減っていた。
もうひとつは脳梁をまたぐような神経線維をもつneuronをとってきて培養して、神経栄養因子の依存性を検討。胎生１９日目までと生後数日で、大きく異なっていた。まず形態的に、胎生１９日目までは四方に突起をのばすものの、生後数日のものでは１本しか延びない。極性の問題か。そして胎生１９日目までのneuronでは神経栄養因子による生存の促進は見られなかったが、生後数日では顕著にその効果が現れた。
やはり発達的にみても下位ニューロンのほうが先だから、栄養因子の依存性もそれだけ早いということなのだろうか。
帰宅して風呂にゆっくり浸かり、ヨーグルトをたべたらすっかり元気です。
今日はOと助教の論文読み会がありました。
Oは神経栄養因子の軸索末端からの取り込みについて。
BDNFと受容体のTrkBは結合して、軸索を介して生存シグナルが輸送されることが知られていますが、BDNFに巨大なビーズをつけ、とりこめないようにした実験で、TrkBが単体で生存シグナルを輸送しうることは照明されました。でも生理的な条件下で、複合体を形成して輸送されているのか、この論文からではわからなかった。
自分はES細胞から単一のneuronal progenitor cellをつくってneuronに分化させたという報告と、それを利用したaxon degenerationモデル、またaxonal degenerationをひきおこす分子の探索。
galectin-1という分子をみつけて検討していました。
助教は神経栄養因子シグナリングが脳においてどの時期に依存しているかの報告。
BDNFノックアウトマウスはふつう生後すぐ死亡してしまうが、まれに数日間生きる個体がいて、それを用いた脳での検討。脳でもアポトーシスによって神経細胞が減っていた。
もうひとつは脳梁をまたぐような神経線維をもつneuronをとってきて培養して、神経栄養因子の依存性を検討。胎生１９日目までと生後数日で、大きく異なっていた。まず形態的に、胎生１９日目までは四方に突起をのばすものの、生後数日のものでは１本しか延びない。極性の問題か。そして胎生１９日目までのneuronでは神経栄養因子による生存の促進は見られなかったが、生後数日では顕著にその効果が現れた。
やはり発達的にみても下位ニューロンのほうが先だから、栄養因子の依存性もそれだけ早いということなのだろうか。
iN細胞
未読ですが。
http://headlines.yahoo.co.jp/hl?a=20100128-00000017-mai-soci
体細胞を直接神経細胞にできるのか。。
http://headlines.yahoo.co.jp/hl?a=20100128-00000017-mai-soci
体細胞を直接神経細胞にできるのか。。
synapse elimination
Mechanism of synapse disassembly at the developing neuromuscular junction
Nguyen,Q.T.; Lichtman,J.W.
Curr.Opin.Neurobiol., 1996, 6, 1, 104-112, ENGLAND
ほ乳類の発生途上の神経系では、シナプスの形成／消失が繰り返されている。こういったシナプスのリモデリングによって、軸索が、ある標的に対しては結合を強め、別の標的に対しては完全に撤退することを可能にしている。その代表的な例が、複数の軸索による神経支配から単一の軸索による神経支配へと移行することである。この神経支配の消失は、同じjunctionを支配している軸索間の長期にわたる競争によって引き起こされると考えられる。シナプスの活動は同期しておらず、こういった差が競争のもとになる可能性がある。また、シナプスの活動とは関係なくシナプスが失われることもある。シナプスの活動依存的／非依存的なシナプスの消失をみていくことで、発生期におけるシナプスの再構築のメカニズムが明らかになるだろう（今後に期待。）
Rapid synapse elimination after postsynaptic protein synthesis inhibition in vivo.
McCann CM, Nguyen QT, Santo Neto H, Lichtman JW.
J Neurosci. 2007 May 30;27(22):6064-7
シナプスを維持するのにretrogradeなシグナルがどのような役割を果たすのか調べるため、標的骨格筋での蛋白質合成をin vivoで阻害し、軸索末端においてどうなるか、そのようすをモニターした。１２時間以内に、軸索末端は萎縮し、正常な後シナプス部位から退縮し始めた。これは正常な発生におけるシナプスの消失と構造的に似ていた。このことから、標的骨格筋由来の、寿命の短い何らかの因子が、adultではシナプスの維持に働き、発生時にはsynapse eliminationを制御すると考えられる。
因子の候補としては栄養因子、protease inhibor、接着分子か？
Nguyen,Q.T.; Lichtman,J.W.
Curr.Opin.Neurobiol., 1996, 6, 1, 104-112, ENGLAND
ほ乳類の発生途上の神経系では、シナプスの形成／消失が繰り返されている。こういったシナプスのリモデリングによって、軸索が、ある標的に対しては結合を強め、別の標的に対しては完全に撤退することを可能にしている。その代表的な例が、複数の軸索による神経支配から単一の軸索による神経支配へと移行することである。この神経支配の消失は、同じjunctionを支配している軸索間の長期にわたる競争によって引き起こされると考えられる。シナプスの活動は同期しておらず、こういった差が競争のもとになる可能性がある。また、シナプスの活動とは関係なくシナプスが失われることもある。シナプスの活動依存的／非依存的なシナプスの消失をみていくことで、発生期におけるシナプスの再構築のメカニズムが明らかになるだろう（今後に期待。）
Rapid synapse elimination after postsynaptic protein synthesis inhibition in vivo.
McCann CM, Nguyen QT, Santo Neto H, Lichtman JW.
J Neurosci. 2007 May 30;27(22):6064-7
シナプスを維持するのにretrogradeなシグナルがどのような役割を果たすのか調べるため、標的骨格筋での蛋白質合成をin vivoで阻害し、軸索末端においてどうなるか、そのようすをモニターした。１２時間以内に、軸索末端は萎縮し、正常な後シナプス部位から退縮し始めた。これは正常な発生におけるシナプスの消失と構造的に似ていた。このことから、標的骨格筋由来の、寿命の短い何らかの因子が、adultではシナプスの維持に働き、発生時にはsynapse eliminationを制御すると考えられる。
因子の候補としては栄養因子、protease inhibor、接着分子か？
論文など
ざっと見て、とにかく知識を頭に入れることを優先することにする。
Agrin promotes synaptic differentiation by counteracting an inhibitory effect of neurotransmitter
11088-11093 PNAS August 2, 2005
agrinとアセチルコリン（ACh）の、NMJ形成に及ぼす影響について。
agrin ノックアウトマウスはNMJが維持できない。いっぽう、AChが産生されないChATノックアウトマウスではNMJはたくさん（extensively）できる。
ここでagrin, ACh両者が存在しないダブルノックアウトマウス（dko）を作製しNMJの形成を見たところ、NMJは形成されていた。細胞でも同様の結果。
一連の結果から、
→AChは発生期のpostsynaptic siteを不安定化させる
→そしてagrinはAChのもつ「antisynaptogenic」な影響に対抗している
※dkoで完全にレスキューされたかというとそうでもなく、AChRに届いていないfiberがあったり、逆にひとつのfiberが複数のAChRを支配していたりする。
Agrin promotes synaptic differentiation by counteracting an inhibitory effect of neurotransmitter
11088-11093 PNAS August 2, 2005
agrinとアセチルコリン（ACh）の、NMJ形成に及ぼす影響について。
agrin ノックアウトマウスはNMJが維持できない。いっぽう、AChが産生されないChATノックアウトマウスではNMJはたくさん（extensively）できる。
ここでagrin, ACh両者が存在しないダブルノックアウトマウス（dko）を作製しNMJの形成を見たところ、NMJは形成されていた。細胞でも同様の結果。
一連の結果から、
→AChは発生期のpostsynaptic siteを不安定化させる
→そしてagrinはAChのもつ「antisynaptogenic」な影響に対抗している
※dkoで完全にレスキューされたかというとそうでもなく、AChRに届いていないfiberがあったり、逆にひとつのfiberが複数のAChRを支配していたりする。
論文を読む時間ができた
natureから、myogenic progenitor cell関連を２報。
いまだに謎が多い、筋肉の幹細胞について。
A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells
nature Vol 435|16 June 2005
脊椎動物の発生の途上では、胎生期のmyogenesisのphaseにしたがって、骨格筋の形成・成長が促進される。最初期の胎生期の筋細胞のoriginや、それが分子メカニズム的にどのように制御されているのかはよく研究されているが、その後のmyogenesisに関してはよくわかっていない。
このグループは「Pax3, Pax7（転写因子）は発現するが、骨格筋特異的マーカーを発現しない」という新しい細胞のpopulationを同定した。これらは発生期を通じて胎仔の胴や四肢の筋において、分裂増殖する種として維持される。研究グループはPax3レポーター（GFP）を用いることで、これらのpopulationは骨格筋の前駆細胞であり、その後myogenicになり骨格筋を形成することが明らかになった。発生後期には、これらのpopulationが生後の筋に特徴的なsatellite cellとなる。
Pax3, Pax7をともに欠損したマウスの筋では、ある程度までしか発達しなくなってしまい、発生初期の筋だけが形成される。Pax3 or Pax7を欠いた細胞は死ぬか、あるいはmyogenicな運命をたどらない。
結論として、Pax3/Pax7依存的なresident前駆細胞のpopulationはmyogenicな細胞を形作り、骨格筋の形成に重要である。
これは胎生期の話で、adultのsatellite cellでもPax3/Pax7は機能発揮に重要なのかはつい最近まで検討されておらず、それをやったのが次の論文で、予想外の結果が出ています：
Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements
nature Vol 460|30 July 2009
ほ乳類筋前駆細胞がもつmyogenicなpotentialや自身の生存、成長はPax3やPax7に依存している。（胎生期にはPax3&Pax7, 出生直後にはPax7のみ。）しかしこういった研究はin vitroでしかやられてきておらず、in vivoでの検討はされてこなかった。
そこで研究グループはinducible Cre/loxP lineage tracingとconditional gene inactivationを組み合わせ、前脛骨筋でmuscle regenerationの検討を行った。具体的には、tamoxifen-inducible Cre recombinase-oestrogen受容体というfusionタンパクを発現するアレル（Pax7もつぶしてある）をもったマウスと、Creの発現依存的にPax7 nullとなるようなアレルをもったマウスをかけ合わせる。これによって、tamoxifenを投与するとCreが発現し、Pax7 nullとなる。このようなピタゴラスイッチ的な仕組みによって、「胎生期ではPax7が発現しているが、adultではPax7が欠損する」ということが可能になり、胎生期でのPax7欠損の影響を回避できる。
予想外なことに、adultマウスでPax7が不活性化されても、そのsatellite cellはcontrolと同様にmuscle regenerationの機能を果たした。Pax7発現のないこれらのsatellite cellは分裂増殖することができ、sublaminalな定位置を占めることもできる。またさらなるregenerationにおいてもサポートすることができる。さらに、Pax3とPax7を同時に不活性化させても、やはり正常なmuscle regenerationが起こった。様々なtime pointでPax7を不活性化させたところ、Pax7は前駆細胞がquiescenceになるjuvenileな時期までしか必要ではないことが明らかになった。またin vitroで、前駆細胞がadult satellite cellへ移行するときのPax7依存性は、cell-autonomousに変化することがわかった。
結論として、embryonic→juvenile→adultと個体が成長するにつれて、muscle stem cellはそのgenetic requirementを変えていく。
いまだに謎が多い、筋肉の幹細胞について。
A Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells
nature Vol 435|16 June 2005
脊椎動物の発生の途上では、胎生期のmyogenesisのphaseにしたがって、骨格筋の形成・成長が促進される。最初期の胎生期の筋細胞のoriginや、それが分子メカニズム的にどのように制御されているのかはよく研究されているが、その後のmyogenesisに関してはよくわかっていない。
このグループは「Pax3, Pax7（転写因子）は発現するが、骨格筋特異的マーカーを発現しない」という新しい細胞のpopulationを同定した。これらは発生期を通じて胎仔の胴や四肢の筋において、分裂増殖する種として維持される。研究グループはPax3レポーター（GFP）を用いることで、これらのpopulationは骨格筋の前駆細胞であり、その後myogenicになり骨格筋を形成することが明らかになった。発生後期には、これらのpopulationが生後の筋に特徴的なsatellite cellとなる。
Pax3, Pax7をともに欠損したマウスの筋では、ある程度までしか発達しなくなってしまい、発生初期の筋だけが形成される。Pax3 or Pax7を欠いた細胞は死ぬか、あるいはmyogenicな運命をたどらない。
結論として、Pax3/Pax7依存的なresident前駆細胞のpopulationはmyogenicな細胞を形作り、骨格筋の形成に重要である。
これは胎生期の話で、adultのsatellite cellでもPax3/Pax7は機能発揮に重要なのかはつい最近まで検討されておらず、それをやったのが次の論文で、予想外の結果が出ています：
Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements
nature Vol 460|30 July 2009
ほ乳類筋前駆細胞がもつmyogenicなpotentialや自身の生存、成長はPax3やPax7に依存している。（胎生期にはPax3&Pax7, 出生直後にはPax7のみ。）しかしこういった研究はin vitroでしかやられてきておらず、in vivoでの検討はされてこなかった。
そこで研究グループはinducible Cre/loxP lineage tracingとconditional gene inactivationを組み合わせ、前脛骨筋でmuscle regenerationの検討を行った。具体的には、tamoxifen-inducible Cre recombinase-oestrogen受容体というfusionタンパクを発現するアレル（Pax7もつぶしてある）をもったマウスと、Creの発現依存的にPax7 nullとなるようなアレルをもったマウスをかけ合わせる。これによって、tamoxifenを投与するとCreが発現し、Pax7 nullとなる。このようなピタゴラスイッチ的な仕組みによって、「胎生期ではPax7が発現しているが、adultではPax7が欠損する」ということが可能になり、胎生期でのPax7欠損の影響を回避できる。
予想外なことに、adultマウスでPax7が不活性化されても、そのsatellite cellはcontrolと同様にmuscle regenerationの機能を果たした。Pax7発現のないこれらのsatellite cellは分裂増殖することができ、sublaminalな定位置を占めることもできる。またさらなるregenerationにおいてもサポートすることができる。さらに、Pax3とPax7を同時に不活性化させても、やはり正常なmuscle regenerationが起こった。様々なtime pointでPax7を不活性化させたところ、Pax7は前駆細胞がquiescenceになるjuvenileな時期までしか必要ではないことが明らかになった。またin vitroで、前駆細胞がadult satellite cellへ移行するときのPax7依存性は、cell-autonomousに変化することがわかった。
結論として、embryonic→juvenile→adultと個体が成長するにつれて、muscle stem cellはそのgenetic requirementを変えていく。
木曜日
セミナーで良い質問ができるように、ただ漫然と読むのではなくて書評というか、コメントを書いてみます。
the liprin protein SYD-2 regulates the differentiation of presynaptic termini in C. elegans
nature vol401 23 sep 1999
シナプスではpre/ post双方の細胞表面下でspecializeされた構造体がつくられる。
presynapticな先端にはactive zoneと呼ばれる電子密度の高い構造体があって、vesicleのドッキングや放出を行う。このactive zoneは何で構成されているのか、どのようにしてできるのかなど明らかになっていない。
研究グループは線虫のsyd-2変異体を解析したところ、いくつかのpresynapticタンパクやGFP markerの局在が分散してしまった。（そもそもsynaptobrevinの線虫ホモログ::GFPのスクリーニングでsyd-2がとれてきた)
→syd-2 mutantのactive zoneは長く伸びる（電顕）
→しかし、１シナプスあたりのvesicle数は野生型と変わらない
→synaptic transmissionはややimpaired
syd-2遺伝子産物はliprinと相同性が高い。
liprinはRPTR(recptor proteins with tyrosine phophatase activity)という蛋白質と相互作用する。
SYD-2蛋白質はvesicleの存在と関係なくpresynaptic terminiに局在、cell autonomousに機能発揮。
SYD-2の機能は「シナプスにおけるRPTPシグナリングの細胞内アンカーとして、active zoneを形成する」ことなのではないか？と主張。
SYD-2というタンパクが見つかった初めての報告か。syd-2 mutantで見られたSNB-1::GFPの分散した構造をどう解釈するか？vesicle distributionそのものが変化してしまったのか、SNB-1::GFPとplasma membraneとのassociationが変化してしまったのか。
ただtransmissionがおかしくなっているのでvesicleがあってもactive zoneの形成に不具合が生じているのは確か。
あとRPTPというのを全然しらなかったのでピンと来ませんが、どうもこの時点ではくわしくわかってなさそうでした。
うわーすごい時間かかってしまった。これは続かなさそう・・・
the liprin protein SYD-2 regulates the differentiation of presynaptic termini in C. elegans
nature vol401 23 sep 1999
シナプスではpre/ post双方の細胞表面下でspecializeされた構造体がつくられる。
presynapticな先端にはactive zoneと呼ばれる電子密度の高い構造体があって、vesicleのドッキングや放出を行う。このactive zoneは何で構成されているのか、どのようにしてできるのかなど明らかになっていない。
研究グループは線虫のsyd-2変異体を解析したところ、いくつかのpresynapticタンパクやGFP markerの局在が分散してしまった。（そもそもsynaptobrevinの線虫ホモログ::GFPのスクリーニングでsyd-2がとれてきた)
→syd-2 mutantのactive zoneは長く伸びる（電顕）
→しかし、１シナプスあたりのvesicle数は野生型と変わらない
→synaptic transmissionはややimpaired
syd-2遺伝子産物はliprinと相同性が高い。
liprinはRPTR(recptor proteins with tyrosine phophatase activity)という蛋白質と相互作用する。
SYD-2蛋白質はvesicleの存在と関係なくpresynaptic terminiに局在、cell autonomousに機能発揮。
SYD-2の機能は「シナプスにおけるRPTPシグナリングの細胞内アンカーとして、active zoneを形成する」ことなのではないか？と主張。
SYD-2というタンパクが見つかった初めての報告か。syd-2 mutantで見られたSNB-1::GFPの分散した構造をどう解釈するか？vesicle distributionそのものが変化してしまったのか、SNB-1::GFPとplasma membraneとのassociationが変化してしまったのか。
ただtransmissionがおかしくなっているのでvesicleがあってもactive zoneの形成に不具合が生じているのは確か。
あとRPTPというのを全然しらなかったのでピンと来ませんが、どうもこの時点ではくわしくわかってなさそうでした。
うわーすごい時間かかってしまった。これは続かなさそう・・・
読み会（二人目)
Killers、かっこ良い。いまさらですが。
SYD-1, a presynaptic protein with PDZ, C2 and rhoGAP-like domains, specifies axon identity in C. elegans
Nature Neuroscience 5, 1137 - 1146 (2002)
発生期の神経においてaxon/dendriteがどう決定されるのか、という話だと思います。
線虫はよくわからない・・・
神経軸策のidentityは神経前終末側の特殊化（specialization、ピンとこない言葉）によって決定される。
C.elegansのsyd-1遺伝子のloss-of-function変異
→GABA陽性のMNにおいて、axon限定なはずの「神経前終末側の特殊化」がdendriteでも起こってしまった。（発生初期）
→しかし発生後期における極性転換？(polarity respecification)にはsyd-1は必要ではない
あとは機能発揮に必要なドメイン探し。
SYD-1タンパクはPDZ, C2, rho-GAP-likeドメインをもち、mature neuronでは神経前終末に局在。
rhoGAPドメインを欠いたSYD-1→neurite outgrowth/guidanceを阻害。
syd-1は極性の獲得時におけるaxon identity決定に関わるのではないか。
abstractだけ訳しても何が何だかわからないけれど。
あとこれもおもしろそうだった。ゼブラフィッシュのstudyぽい。
Nature Neuroscience 4, 1093 - 1101 (2001) Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF
SYD-1, a presynaptic protein with PDZ, C2 and rhoGAP-like domains, specifies axon identity in C. elegans
Nature Neuroscience 5, 1137 - 1146 (2002)
発生期の神経においてaxon/dendriteがどう決定されるのか、という話だと思います。
線虫はよくわからない・・・
神経軸策のidentityは神経前終末側の特殊化（specialization、ピンとこない言葉）によって決定される。
C.elegansのsyd-1遺伝子のloss-of-function変異
→GABA陽性のMNにおいて、axon限定なはずの「神経前終末側の特殊化」がdendriteでも起こってしまった。（発生初期）
→しかし発生後期における極性転換？(polarity respecification)にはsyd-1は必要ではない
あとは機能発揮に必要なドメイン探し。
SYD-1タンパクはPDZ, C2, rho-GAP-likeドメインをもち、mature neuronでは神経前終末に局在。
rhoGAPドメインを欠いたSYD-1→neurite outgrowth/guidanceを阻害。
syd-1は極性の獲得時におけるaxon identity決定に関わるのではないか。
abstractだけ訳しても何が何だかわからないけれど。
あとこれもおもしろそうだった。ゼブラフィッシュのstudyぽい。
Nature Neuroscience 4, 1093 - 1101 (2001) Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF
読み会
Rapamycin activation of 4E-BP prevents parkinsonian dopaminergic neuron loss
Nature Neuroscience 12, 1129 - 1135 (2009)
パーキンソン病の話。
常染色体劣性のパーキンソニズムはPINK1やPARK2の変異によって引き起こされ、ドパミン神経の脱落などがその特徴である。
研究グループは、治療につながりそうなpathwayを探すためDrosophila parkとPink1と遺伝学的にリンクしているファクターを同定した。
→translation inhibitorであるThor (4E-BP)がみつかった
→Thor の過剰発現により病理を反映するphenotypeがすべて抑制された（ハエ）
4E-BPはTOR inhibitorであるrapamycin (TOR =Target Of Rapamycin)により活性化
→Pink1変異体やpark変異体のpathologyをある程度抑制(ハエ)、
→PARK2変異をもつ患者由来の細胞においてミトコンドリアの障害も改善
話は変わって、「4E-BPはLRRK2優性変異により抑制される」ことを受けて
LRRK2 ハエホモログのknock down？→4E-BPが活性化、Pink1変異体やpark変異体のpathologyも抑制できた
4E-BPをうまく調節してやればパーキンソニズムの治療に使えるかもしれない。
Nature Neuroscience 12, 1129 - 1135 (2009)
パーキンソン病の話。
常染色体劣性のパーキンソニズムはPINK1やPARK2の変異によって引き起こされ、ドパミン神経の脱落などがその特徴である。
研究グループは、治療につながりそうなpathwayを探すためDrosophila parkとPink1と遺伝学的にリンクしているファクターを同定した。
→translation inhibitorであるThor (4E-BP)がみつかった
→Thor の過剰発現により病理を反映するphenotypeがすべて抑制された（ハエ）
4E-BPはTOR inhibitorであるrapamycin (TOR =Target Of Rapamycin)により活性化
→Pink1変異体やpark変異体のpathologyをある程度抑制(ハエ)、
→PARK2変異をもつ患者由来の細胞においてミトコンドリアの障害も改善
話は変わって、「4E-BPはLRRK2優性変異により抑制される」ことを受けて
LRRK2 ハエホモログのknock down？→4E-BPが活性化、Pink1変異体やpark変異体のpathologyも抑制できた
4E-BPをうまく調節してやればパーキンソニズムの治療に使えるかもしれない。
CCM2 Mediates Death Signaling by the TrkA Receptor Tyrosine Kinase
ひさしぶりにちゃんと一本読んだ。
CCM2 Mediates Death Signaling by the TrkA Receptor Tyrosine Kinase
Neuron, Volume 63, Issue 5, 585-591, 10 September 2009
NGFの受容体にはTrkAとp75があって、p75がもっぱら神経細胞死をひきおこすと考えられていた。
しかし、近年TrkAも細胞死をひきおこすことがわかった。そのメカニズムは不明だった。
レポータースクリーニング（だったか）の結果CCM2という、脳形成の異常に関連する遺伝子産物がTrkAと相互作用してNGF-dependentなapoptosisをひきおこすことが明らかになった。
さらに欠損体やmutantを用いて、TrkA/CCM2のどの部位が結合に必要で、どの部位が細胞死シグナリングに関係するのかを調べた。
その結果、CCM2はTrkAの膜近傍のphosphotyrosine binding domain (PTB)を介して結合していることがわかった。さらにPTB domainはTrkAと特異的に相互作用するのに必須で、Karet domain (CCM2のもうひとつのsubdomain)は細胞死のシグナル経路につながっていることがわかった。
最後に、ヒト髄芽腫や神経細胞芽腫といった小児癌由来の細胞でCCM2とTrkAを導入するとその細胞の生存率が低下する（たくさん死ぬ）ことがわかった。
これに関連して、じっさいの神経細胞芽腫の患者において、CCM2/TrkAの発現レベルと患者の生存率の関係を調べてみた。統計調査の結果、CCM2/TrkAの発現レベルが高いと生存率が高まることがわかった。（このへんうろ覚え）
ということでスクリーニングから始まりシグナリングを明らかにして細胞、さらにヒトへ、とかなり盛りだくさんでした。
CCM2 Mediates Death Signaling by the TrkA Receptor Tyrosine Kinase
Neuron, Volume 63, Issue 5, 585-591, 10 September 2009
NGFの受容体にはTrkAとp75があって、p75がもっぱら神経細胞死をひきおこすと考えられていた。
しかし、近年TrkAも細胞死をひきおこすことがわかった。そのメカニズムは不明だった。
レポータースクリーニング（だったか）の結果CCM2という、脳形成の異常に関連する遺伝子産物がTrkAと相互作用してNGF-dependentなapoptosisをひきおこすことが明らかになった。
さらに欠損体やmutantを用いて、TrkA/CCM2のどの部位が結合に必要で、どの部位が細胞死シグナリングに関係するのかを調べた。
その結果、CCM2はTrkAの膜近傍のphosphotyrosine binding domain (PTB)を介して結合していることがわかった。さらにPTB domainはTrkAと特異的に相互作用するのに必須で、Karet domain (CCM2のもうひとつのsubdomain)は細胞死のシグナル経路につながっていることがわかった。
最後に、ヒト髄芽腫や神経細胞芽腫といった小児癌由来の細胞でCCM2とTrkAを導入するとその細胞の生存率が低下する（たくさん死ぬ）ことがわかった。
これに関連して、じっさいの神経細胞芽腫の患者において、CCM2/TrkAの発現レベルと患者の生存率の関係を調べてみた。統計調査の結果、CCM2/TrkAの発現レベルが高いと生存率が高まることがわかった。（このへんうろ覚え）
ということでスクリーニングから始まりシグナリングを明らかにして細胞、さらにヒトへ、とかなり盛りだくさんでした。
BDNF関連
Neuronal release of proBDNF
Nature Neuroscience 12, 113 - 115 (2009)
proBDNFと成熟したBDNFは異なる受容体と結合する。これにより、多様な神経活動を可能にしている。
内因性BDNFのisoformを定量する技術を利用して、マウスのニューロン（どのニューロン？）はproBDNFとmatureBDNFの両方を分泌(secrete)することが分かった。
proBDNFとp75の発現レベル（？）はperinatalの時期にもっとも高く、その後adultでは減少するが依然として検出は可能という。
このことから、BDNFの活動は「proBDNFあるいはmature BDNFの分泌」、「p75やTrkBのローカルな発現」により制御されていることが明らかになった。
うーん。アブストだけ読んでもどういう実験をしているのかイメージできない…。
Nature Neuroscience 12, 113 - 115 (2009)
proBDNFと成熟したBDNFは異なる受容体と結合する。これにより、多様な神経活動を可能にしている。
内因性BDNFのisoformを定量する技術を利用して、マウスのニューロン（どのニューロン？）はproBDNFとmatureBDNFの両方を分泌(secrete)することが分かった。
proBDNFとp75の発現レベル（？）はperinatalの時期にもっとも高く、その後adultでは減少するが依然として検出は可能という。
このことから、BDNFの活動は「proBDNFあるいはmature BDNFの分泌」、「p75やTrkBのローカルな発現」により制御されていることが明らかになった。
うーん。アブストだけ読んでもどういう実験をしているのかイメージできない…。
APPの生理機能
最近の話題。
Presynaptic and Postsynaptic Interaction of the Amyloid Precursor Protein Promotes Peripheral and Central Synaptogenesis
The Journal of Neuroscience, September 2, 2009, 29(35):10788-10801
アルツハイマー病（AD)におけるAPPの役割は知られているが、APPの生理的な機能は良く分かっておらず、議論が続いている。
研究グループは以前、「APPはneuromuscular synapseを媒介し発達させるのに必要である」という報告をしている。今回はAPPをpresynaptic motor neuronあるいはpostsynaptic muscleコンディショナルに欠損させたマウスを作出し、 これらのalleleをAPLP2-null backgroundに掛け合わせた（いずれかでレスキューされることを期待）。
予想外にも、pre/postいずれの部位においてAPPを不活性化しても germline deletionに似たneuromuscular synapseの障害が見られ、postsynapticのAPPはhigh-affinityコリントランスポーターのpresynaptic targetingやsynaptic transmissionに必須であることがわかった(?)。HEK293細胞と海馬由来の初代培養神経細胞とのmixed-cultureアッセイを用い、HEK293細胞にAPPを発現させると、HEK293細胞とcontactしている軸索でsynaptogenesisが促進されることがわかった。 さらにこの活動は神経側のAPPに依存し、APPの細胞外・細胞内どちらの領域も必要であることも明らかになった。APPの細胞内領域はMint1やCaskと複合体を形成し、対応するSynCAM配列でも代替可能だった。
これらのvitroやvivoの研究成果により、APPがシナプス接着分子(adhesion molecule)であることが明らかになった。研究グループは、transsynapticなAPPの相互作用がシナプスの機能を調節しており、APPの接着分子としての機能が阻害されることがシナプス障害やAD病理につながるのではと主張している。
Presynaptic and Postsynaptic Interaction of the Amyloid Precursor Protein Promotes Peripheral and Central Synaptogenesis
The Journal of Neuroscience, September 2, 2009, 29(35):10788-10801
アルツハイマー病（AD)におけるAPPの役割は知られているが、APPの生理的な機能は良く分かっておらず、議論が続いている。
研究グループは以前、「APPはneuromuscular synapseを媒介し発達させるのに必要である」という報告をしている。今回はAPPをpresynaptic motor neuronあるいはpostsynaptic muscleコンディショナルに欠損させたマウスを作出し、 これらのalleleをAPLP2-null backgroundに掛け合わせた（いずれかでレスキューされることを期待）。
予想外にも、pre/postいずれの部位においてAPPを不活性化しても germline deletionに似たneuromuscular synapseの障害が見られ、postsynapticのAPPはhigh-affinityコリントランスポーターのpresynaptic targetingやsynaptic transmissionに必須であることがわかった(?)。HEK293細胞と海馬由来の初代培養神経細胞とのmixed-cultureアッセイを用い、HEK293細胞にAPPを発現させると、HEK293細胞とcontactしている軸索でsynaptogenesisが促進されることがわかった。 さらにこの活動は神経側のAPPに依存し、APPの細胞外・細胞内どちらの領域も必要であることも明らかになった。APPの細胞内領域はMint1やCaskと複合体を形成し、対応するSynCAM配列でも代替可能だった。
これらのvitroやvivoの研究成果により、APPがシナプス接着分子(adhesion molecule)であることが明らかになった。研究グループは、transsynapticなAPPの相互作用がシナプスの機能を調節しており、APPの接着分子としての機能が阻害されることがシナプス障害やAD病理につながるのではと主張している。
最新情報
Nature 460, 632-636 (30 July 2009)
Presenilins are essential for regulating neurotransmitter release
プレセニリン変異は家族性アルツハイマー病の主な原因で、プレセニリン活性の欠損やアミロイドβの蓄積がシナプスを傷害し、アルツハイマー病理につながると考えられている。
しかし具体的にどうシナプス障害が起こるのかよくわかっていなかった。
筆者らは遺伝学的に前シナプス（CA3）あるいは後シナプス（CA1）の神経細胞においてコンディショナルにプレセニリンを不活性化した。すると前シナプスでプレセニリンを欠落させた場合にのみLTP減少、シナプス可塑性も変化。
open-channel NMDA (N-methyl-d-aspartate) 受容体のアンタゴニストである MK-801を使ってグルタミン酸の放出を測定→前シナプスでプレセニリン不活性化のときのみ減少。
ほかにも、ER内Ca2+貯蓄をなくすthapsigarginや、貯蓄からの放出を阻害するリアノジン受容体阻害剤などで、前シナプスプレセニリン不活性化と似たような現象が起きた。
つまりプレセニリンは何をしているのかというと、「前シナプスで細胞内Ca2+放出をmodulate→活性依存的な神経伝達物質の放出の制御」ということのようです。
筆者らはアルツハイマー病の早期の病理として、前シナプスの障害があるのではないかと言っていました。
Presenilins are essential for regulating neurotransmitter release
プレセニリン変異は家族性アルツハイマー病の主な原因で、プレセニリン活性の欠損やアミロイドβの蓄積がシナプスを傷害し、アルツハイマー病理につながると考えられている。
しかし具体的にどうシナプス障害が起こるのかよくわかっていなかった。
筆者らは遺伝学的に前シナプス（CA3）あるいは後シナプス（CA1）の神経細胞においてコンディショナルにプレセニリンを不活性化した。すると前シナプスでプレセニリンを欠落させた場合にのみLTP減少、シナプス可塑性も変化。
open-channel NMDA (N-methyl-d-aspartate) 受容体のアンタゴニストである MK-801を使ってグルタミン酸の放出を測定→前シナプスでプレセニリン不活性化のときのみ減少。
ほかにも、ER内Ca2+貯蓄をなくすthapsigarginや、貯蓄からの放出を阻害するリアノジン受容体阻害剤などで、前シナプスプレセニリン不活性化と似たような現象が起きた。
つまりプレセニリンは何をしているのかというと、「前シナプスで細胞内Ca2+放出をmodulate→活性依存的な神経伝達物質の放出の制御」ということのようです。
筆者らはアルツハイマー病の早期の病理として、前シナプスの障害があるのではないかと言っていました。
読み会
夕刻ぼーっと外を見ていると、やがて陽が沈み、すると急に空に赤みが消え、あたりがいちめん藍色になる瞬間がある。そのあとは真っ暗になっていくだけなんですが、なにもかもが海の底に沈んでしまったかのような、そんな３０分くらいの時間帯が好きです。
Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes
Cell, Volume 79, Issue 6, 957-970, 16 December 1994
Requirement for the Homeobox Gene Hb9 in the Consolidation of Motor Neuron Identity
Neuron, Volume 23, Issue 4, 659-674, 1 August 1999
「運動ニューロンのアイデンティティ確立にはHb9が必要」
基本的にはHb9ノックアウトマウスの解析。
MNのpopulationを細かく検討した結果、Hb9ノックアウトマウスではHb9を発現しているはずのMNがV2 interneuron様のmolecular featureを獲得していた（＝fate conversion）
しかもこれらのニューロンは脊髄から出て、肋間では一部がBTXとmergeしていた（ただし異常な架橋構造などあり）
横隔膜では既報どおりニューロンは来てない
ということでHb9が失われたMNは「MNではない、なにか」になってしまっているらしい。ちょっと怖い。
A novel role for embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at the neuromuscular junction
J. Biol. Chem, 10.1074/jbc.M809491200
「embiginの新たな機能：NMJで運動ニューロン終末のsproutingを促進する」
背景として、いちど神経を取り去った筋肉ではNMJ形成のためのさまざまなタンパクを合成するらしく、foreignな神経終末が来てもそれを受け入れてNMJ形成してしまうらしい。
このとき、具体的にどんなタンパクが合成されてるのか？を調べるべくinnervation時/denervation時のmRNAを比較し、その発現レベルに差があるヤツをスクリーニング→候補にembigin
（NCAM様の構造をもっているらしく、それも候補にあがった理由のひとつ）
embiginは一回膜貫通型の構造をとっていて、細胞内ドメインがシグナル伝達にかかわるだろうと考えられている。
そこでembigin全長の過剰発現マウスと細胞内ドメインを欠いたembigin過剰発現マウスを作出、解析
→前者では終末のsproutingが起こり、後者では起こらなかった
→siRNAのノックダウンにより終末のretractionが起こる、NCAM-/-で増悪
まとめとして、embiginはNCAMのmuscle-nerve間接着を増強させていると。
また助教から仕事が降りてきたのでとうぶん忙しくなりそうです。
Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes
Cell, Volume 79, Issue 6, 957-970, 16 December 1994
Requirement for the Homeobox Gene Hb9 in the Consolidation of Motor Neuron Identity
Neuron, Volume 23, Issue 4, 659-674, 1 August 1999
「運動ニューロンのアイデンティティ確立にはHb9が必要」
基本的にはHb9ノックアウトマウスの解析。
MNのpopulationを細かく検討した結果、Hb9ノックアウトマウスではHb9を発現しているはずのMNがV2 interneuron様のmolecular featureを獲得していた（＝fate conversion）
しかもこれらのニューロンは脊髄から出て、肋間では一部がBTXとmergeしていた（ただし異常な架橋構造などあり）
横隔膜では既報どおりニューロンは来てない
ということでHb9が失われたMNは「MNではない、なにか」になってしまっているらしい。ちょっと怖い。
A novel role for embigin to promote sprouting of motor nerve terminals at the neuromuscular junction
J. Biol. Chem, 10.1074/jbc.M809491200
「embiginの新たな機能：NMJで運動ニューロン終末のsproutingを促進する」
背景として、いちど神経を取り去った筋肉ではNMJ形成のためのさまざまなタンパクを合成するらしく、foreignな神経終末が来てもそれを受け入れてNMJ形成してしまうらしい。
このとき、具体的にどんなタンパクが合成されてるのか？を調べるべくinnervation時/denervation時のmRNAを比較し、その発現レベルに差があるヤツをスクリーニング→候補にembigin
（NCAM様の構造をもっているらしく、それも候補にあがった理由のひとつ）
embiginは一回膜貫通型の構造をとっていて、細胞内ドメインがシグナル伝達にかかわるだろうと考えられている。
そこでembigin全長の過剰発現マウスと細胞内ドメインを欠いたembigin過剰発現マウスを作出、解析
→前者では終末のsproutingが起こり、後者では起こらなかった
→siRNAのノックダウンにより終末のretractionが起こる、NCAM-/-で増悪
まとめとして、embiginはNCAMのmuscle-nerve間接着を増強させていると。
また助教から仕事が降りてきたのでとうぶん忙しくなりそうです。
シュワン細胞分化の下流シグナル
UNIQLOCKを導入した。
ユニクロ大好きですから。
Calcineurin/NFAT Signaling Is Required for Neuregulin-Regulated Schwann Cell Differentiation
Science 30 January 2009:
Vol. 323. no. 5914, pp. 651 - 654
「Calcineurin/NFATシグナリングがシュワン細胞の分化に必要」
今までに知られていた事実；
・NRGやErbBのノックアウトマウスでシュワン細胞が死んでいることから、NRG→ErbBでシュワン細胞の増殖とか生存が調節されているようだ
・Ca influx上昇→Calcineurin (=phosphatase)→NFATのリン酸化解除→NFATが核内に移行・転写制御
①CalcineurinのB1サブユニット (CnB1)をneural crestで落とした（wnt creマウスとのかけ合わせ)マウスを作出
→DRG cocultureにおいてCnB1のphosphatase活性が失われた（NFATのリン酸化解除されず）
→さらに神経をみるとaxon/bundleの比率が落ちる
→myelinationにかかわるタンパクのレベル落ちる
→シュワン細胞自体の生存は正常レベル
→nestin creだとこれらの異常は見られない
ということでシュワン細胞のcell autonomousな影響で、myelinationに障害が出ている
②転写制御をくわしく
NRG刺激によりNFAT promoterが動く（レポーターアッセイ）
さらにNFATのnuclear partnerを探した→Sox10だ！（affinity column→MS)
NRG刺激によるKrox20 MSEの活性上昇がSox10共存によりさらに高くなる（＝シナジー効果）、しかもP0 promoterも動く→direct/indirectな調節機構があるっぽい
ユニクロ大好きですから。
Calcineurin/NFAT Signaling Is Required for Neuregulin-Regulated Schwann Cell Differentiation
Science 30 January 2009:
Vol. 323. no. 5914, pp. 651 - 654
「Calcineurin/NFATシグナリングがシュワン細胞の分化に必要」
今までに知られていた事実；
・NRGやErbBのノックアウトマウスでシュワン細胞が死んでいることから、NRG→ErbBでシュワン細胞の増殖とか生存が調節されているようだ
・Ca influx上昇→Calcineurin (=phosphatase)→NFATのリン酸化解除→NFATが核内に移行・転写制御
①CalcineurinのB1サブユニット (CnB1)をneural crestで落とした（wnt creマウスとのかけ合わせ)マウスを作出
→DRG cocultureにおいてCnB1のphosphatase活性が失われた（NFATのリン酸化解除されず）
→さらに神経をみるとaxon/bundleの比率が落ちる
→myelinationにかかわるタンパクのレベル落ちる
→シュワン細胞自体の生存は正常レベル
→nestin creだとこれらの異常は見られない
ということでシュワン細胞のcell autonomousな影響で、myelinationに障害が出ている
②転写制御をくわしく
NRG刺激によりNFAT promoterが動く（レポーターアッセイ）
さらにNFATのnuclear partnerを探した→Sox10だ！（affinity column→MS)
NRG刺激によるKrox20 MSEの活性上昇がSox10共存によりさらに高くなる（＝シナジー効果）、しかもP0 promoterも動く→direct/indirectな調節機構があるっぽい
読み会
Nat Neurosci. 2007 May;10(5):615-22. Epub 2007 Apr 15
Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons.
ALSは運動ニューロンが死んで、最終的に呼吸困難などで死亡する難病。
家族性ALSの原因のひとつSOD1変異は、どの細胞で、どのように悪さをしているのか。これをvitroで調べた。
Jessell博士の「運動ニューロンが光る」Hb9GFP tgマウスを用い、
脊髄由来のprimary MN (PMN)、ES細胞由来のMN (ESMN)で検討。
MNそのものに変異を入れても細胞が小さいなど、mildな変化しか起こらない。
ところがastrocyteに変異を入れて、MNとcocultureすると生存率がぐっと下がる。
astrocyteそのものではなく、その培養上清をMNにかけても生存率が下がる。
この毒性はMN特異的で、interneuronなどの生存率は下がらない。
さいごに、MNの細胞死はBaxのinhibitorで抑制できる→caspase dependentなアポトーシスか？
という感じ。
Nature 410, 1057-1064 (26 April 2001)
Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse
Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons.
ALSは運動ニューロンが死んで、最終的に呼吸困難などで死亡する難病。
家族性ALSの原因のひとつSOD1変異は、どの細胞で、どのように悪さをしているのか。これをvitroで調べた。
Jessell博士の「運動ニューロンが光る」Hb9GFP tgマウスを用い、
脊髄由来のprimary MN (PMN)、ES細胞由来のMN (ESMN)で検討。
MNそのものに変異を入れても細胞が小さいなど、mildな変化しか起こらない。
ところがastrocyteに変異を入れて、MNとcocultureすると生存率がぐっと下がる。
astrocyteそのものではなく、その培養上清をMNにかけても生存率が下がる。
この毒性はMN特異的で、interneuronなどの生存率は下がらない。
さいごに、MNの細胞死はBaxのinhibitorで抑制できる→caspase dependentなアポトーシスか？
という感じ。
Nature 410, 1057-1064 (26 April 2001)
Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse
当日はすらすら書ける
Mくん
C2C12とMNに分化させたES細胞を仕切りに分けて培養、その後仕切りを取り去る→神経がc2c12に向けて軸策を伸ばし、NMJ形成、筋肉の収縮が見られた。（じっさいに収縮している映像があった。気持ち悪かった）
これを脊損の患者さんの脊髄に移植すれば治療できるかもしれない。
問題は、脊髄に移植したMNがaxonを伸ばさないこと。
これにはmyelinが関係しているようだ。（阻害剤の投与→伸長）
Oくん
先週にひきつづきintegrin b1 を神経・筋肉それぞれ特異的にノックアウトしたconditional knockout mouse (cKO mouse)のphenotype解析。
まずはnestin creとの交配によるnestin Itgb1 cKO mouseの解析から。
MN axonの到達やAChR cluster, Itgb1以外のbasal lamina 構成因子、GFAP (Schwann), Synaptophysin (pre)も正常。→ようは異常なし。
つづいてHSA Itgb1 cKOの解析。
こちらは発生が進むにつれ異常が顕著に。
axonはAChRをスルーして伸び放題。
AChR clusterもどうやらmicro clusterのまま。
in vitroでも、agrin投与によるAChR cluster形成が弱い。
助教
JN最新号。
IBMという病気があるらしい。知らなかった。
これは老年性の病気で、筋肉にAβ (とくにAβ42)が蓄積することが知られ、症状はたしか運動障害。
いわば「筋肉のアルツハイマー病」。
これをアルツハイマー病同様、passive immunizationで治療しようという方針。
いきなり人間でやるのはまずいので、まずはモデルマウスでの検討。
モデルマウスはさまざまだが、今回使ったのはc100過剰発現マウスとγ secretaseに変異が入っているマウスを掛け合わせたマウス。
これによって全身にAβ42が大量に産生することになり、じっさいのIBMと同様の所見を得た。
たしかAβ-MAPというAβの塊を注射して抗体をつくらせる。
この技術をつかって同様にIBMモデルマウスに免疫すると、IBM様の症状が有意に回復した。
あとoligomerで悪化。
C2C12とMNに分化させたES細胞を仕切りに分けて培養、その後仕切りを取り去る→神経がc2c12に向けて軸策を伸ばし、NMJ形成、筋肉の収縮が見られた。（じっさいに収縮している映像があった。気持ち悪かった）
これを脊損の患者さんの脊髄に移植すれば治療できるかもしれない。
問題は、脊髄に移植したMNがaxonを伸ばさないこと。
これにはmyelinが関係しているようだ。（阻害剤の投与→伸長）
Oくん
先週にひきつづきintegrin b1 を神経・筋肉それぞれ特異的にノックアウトしたconditional knockout mouse (cKO mouse)のphenotype解析。
まずはnestin creとの交配によるnestin Itgb1 cKO mouseの解析から。
MN axonの到達やAChR cluster, Itgb1以外のbasal lamina 構成因子、GFAP (Schwann), Synaptophysin (pre)も正常。→ようは異常なし。
つづいてHSA Itgb1 cKOの解析。
こちらは発生が進むにつれ異常が顕著に。
axonはAChRをスルーして伸び放題。
AChR clusterもどうやらmicro clusterのまま。
in vitroでも、agrin投与によるAChR cluster形成が弱い。
助教
JN最新号。
IBMという病気があるらしい。知らなかった。
これは老年性の病気で、筋肉にAβ (とくにAβ42)が蓄積することが知られ、症状はたしか運動障害。
いわば「筋肉のアルツハイマー病」。
これをアルツハイマー病同様、passive immunizationで治療しようという方針。
いきなり人間でやるのはまずいので、まずはモデルマウスでの検討。
モデルマウスはさまざまだが、今回使ったのはc100過剰発現マウスとγ secretaseに変異が入っているマウスを掛け合わせたマウス。
これによって全身にAβ42が大量に産生することになり、じっさいのIBMと同様の所見を得た。
たしかAβ-MAPというAβの塊を注射して抗体をつくらせる。
この技術をつかって同様にIBMモデルマウスに免疫すると、IBM様の症状が有意に回復した。
あとoligomerで悪化。
読み会
Oくん「みんなでこれから飲み会に行くのかと思いました」
JN 24 8181- (2004)
Cell 110 385- (2005)
Neuron 52 293- (2006)
JN 24 8181- (2004)
Cell 110 385- (2005)
Neuron 52 293- (2006)
読み会
自分 collagen XVIIIとLH3のglycosyltransferase活性について (Neuron 2006)
motor neuron (MN)伸長異常を示すdiwankaの原因遺伝子がlysyl hydroxylase (LH)3であることを解明
1.まわりのECMが悪いのか？
→diwankaではコラーゲン (col2)の局在がおかしくなる
→MN伸長のガイド役を果たすECMでは3層構造のうちコラーゲンだけが見当たらなかったが他は正常
2.MN伸長そのものが悪いのか？
→LH3の局在はMN伸長直前のadaxial cellにあった
→しかしLHファミリーのLH1, LH2も発現→LH3だけが持つユニークな機能？
→LH3だけがglycosyltransferaseをもち、これがあればdiwankaをレスキュー可能
→glycosyltransferaseの基質としてcollagen XVIIIがある
ということで後者なんじゃないかという主張。
Mくん (MCB ?)
ノックアウトマウスをつくるとき、相同組み換えを起こしてtarget alleleをヘテロにもつES細胞がもとになる。
しかしこのヘテロのES細胞を飼いつづけるとtarget alleleをホモにもつ細胞もできるらしい。
助教 いろんな論文から網羅的に。MN死について。
＜逆行性の軸索輸送の障害は運動ニューロン死をひき起こす＞
運動ニューロンにおいて逆行性の軸索輸送を担当する dynein/dynactin複合体の一方の要素であるdynactinのサブユニット、dynamitin tg mouse
→10ヶ月を過ぎた頃から特に下肢の筋力低下が目立ち始め、MNおよびMN axonの減少（Neuron 34:715-27, 2002）．
ALSに類似した遺伝性の運動神経疾患を有するアラバマ州の大家族において dynactinのp150Glued subunitにミスセンス変異（G59S）の発見（Nat Genet 33; 455-456, 2003）
ただし、dynactin遺伝子変異がなぜ運動神経だけに影響を与えるのかは不明。
motor neuron (MN)伸長異常を示すdiwankaの原因遺伝子がlysyl hydroxylase (LH)3であることを解明
1.まわりのECMが悪いのか？
→diwankaではコラーゲン (col2)の局在がおかしくなる
→MN伸長のガイド役を果たすECMでは3層構造のうちコラーゲンだけが見当たらなかったが他は正常
2.MN伸長そのものが悪いのか？
→LH3の局在はMN伸長直前のadaxial cellにあった
→しかしLHファミリーのLH1, LH2も発現→LH3だけが持つユニークな機能？
→LH3だけがglycosyltransferaseをもち、これがあればdiwankaをレスキュー可能
→glycosyltransferaseの基質としてcollagen XVIIIがある
ということで後者なんじゃないかという主張。
Mくん (MCB ?)
ノックアウトマウスをつくるとき、相同組み換えを起こしてtarget alleleをヘテロにもつES細胞がもとになる。
しかしこのヘテロのES細胞を飼いつづけるとtarget alleleをホモにもつ細胞もできるらしい。
助教 いろんな論文から網羅的に。MN死について。
＜逆行性の軸索輸送の障害は運動ニューロン死をひき起こす＞
運動ニューロンにおいて逆行性の軸索輸送を担当する dynein/dynactin複合体の一方の要素であるdynactinのサブユニット、dynamitin tg mouse
→10ヶ月を過ぎた頃から特に下肢の筋力低下が目立ち始め、MNおよびMN axonの減少（Neuron 34:715-27, 2002）．
ALSに類似した遺伝性の運動神経疾患を有するアラバマ州の大家族において dynactinのp150Glued subunitにミスセンス変異（G59S）の発見（Nat Genet 33; 455-456, 2003）
ただし、dynactin遺伝子変異がなぜ運動神経だけに影響を与えるのかは不明。
読み会
自分はMCB 2005から
AP-2 μ2サブユニットのノックアウトマウスはembryonic lethal (E3.5までも生きられない)
→cell survivalに必要だろう
一方へテロは元気。AP-2 complexのμ2サブユニットおよびαサブユニットでともにタンパク量が落ちているが半減とまでは行かない→complexが不安定になっている、なんらかの代償機構
CD63を用いたendocytosisの評価も野生型と変わらず。
Mくんは・・・なんだっけ
神経細胞の軸索におけるmRNAの分布をマイクロアレイで見た、という報告。
AP-2 μ2サブユニットのノックアウトマウスはembryonic lethal (E3.5までも生きられない)
→cell survivalに必要だろう
一方へテロは元気。AP-2 complexのμ2サブユニットおよびαサブユニットでともにタンパク量が落ちているが半減とまでは行かない→complexが不安定になっている、なんらかの代償機構
CD63を用いたendocytosisの評価も野生型と変わらず。
Mくんは・・・なんだっけ
神経細胞の軸索におけるmRNAの分布をマイクロアレイで見た、という報告。
読み会
自分 Science 13 March 1998: Vol. 279. no. 5357, pp. 1725 - 1729
myo-GDNFマウスを作製。発現レベルの異なる複数ラインを確保。
NMJでhyperinnervationが起こる。neuron数、筋肉の本数は変わらない。
ただしsingle innervationになるのが遅れるだけ。
助教 CNTFにかんする古い論文
CNTFノックアウトマウスは元気で、若干のMN lossはあるものの野生型とたいして変わらない。
ところがCNTF-Rノックアウトマウスは母乳を飲めずに２４時間以内に死亡。
原因は顎の筋肉が動かせないからだとか。
MN lossもたくさん起きている。
「CNTF以外のファクターがCNTF-Rを介してMN survivalに必須なシグナルを流すのでは？」というディスカッション。
CNTF-R自体はGPIアンカーで、LIFRとgp130といっしょにCNTF-R complexを形成する。
なので、下流を流すのはLIFR or gp130。どっちか忘れた。
MくんはCell
マウスneonatalの精巣由来の細胞をある条件下で培養しつづけるとES細胞っぽくなるという報告。
mRNAの発現プロファイル、methylation (acetylation?忘れた)具合がES細胞と似ている。
ES細胞と同様の操作で分化誘導に成功。
さらに母マウスに移してキメラ作製に成功。
myo-GDNFマウスを作製。発現レベルの異なる複数ラインを確保。
NMJでhyperinnervationが起こる。neuron数、筋肉の本数は変わらない。
ただしsingle innervationになるのが遅れるだけ。
助教 CNTFにかんする古い論文
CNTFノックアウトマウスは元気で、若干のMN lossはあるものの野生型とたいして変わらない。
ところがCNTF-Rノックアウトマウスは母乳を飲めずに２４時間以内に死亡。
原因は顎の筋肉が動かせないからだとか。
MN lossもたくさん起きている。
「CNTF以外のファクターがCNTF-Rを介してMN survivalに必須なシグナルを流すのでは？」というディスカッション。
CNTF-R自体はGPIアンカーで、LIFRとgp130といっしょにCNTF-R complexを形成する。
なので、下流を流すのはLIFR or gp130。どっちか忘れた。
MくんはCell
マウスneonatalの精巣由来の細胞をある条件下で培養しつづけるとES細胞っぽくなるという報告。
mRNAの発現プロファイル、methylation (acetylation?忘れた)具合がES細胞と似ている。
ES細胞と同様の操作で分化誘導に成功。
さらに母マウスに移してキメラ作製に成功。
HSP90β
読み会。内容はいずれもうろ覚え。
自分は昨年１０月に出たNeuron論文から
http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081009111026.htm
にも紹介されてました。
「HSP90βはRapsynのturnoverを制御し、結果的にAChR cluster形成・維持も制御する」
αBTX pull down、MS解析→HSP90βがとれた
HSP90βはAChR clusterとcolocalize
HSP90β-Rapsyn-AChRaが結合
阻害剤、miRNA、dominant negativeでcluster減少（vitro, vivo)
CHX（シクロヘキシミド）投与下で阻害剤投与→rapsynが時間依存的に減少。
助教はNeuron1999？ふるい論文
NMJの維持にはBDNF-TrkBシグナルが効いている
TrkBには細胞外領域だけのsplice variantあり。SVはシグナリングに関与しない
免染→FLはclusterときっちり共存、SVは若干もやもや
SVをvirus infectionで筋肉に導入するとdominant negative効果→AChR clusterの「つぶつぶ」が増える
TrkB +/-マウスでも同様の所見。
自分は昨年１０月に出たNeuron論文から
http://www.sciencedaily.com/releases/2008/10/081009111026.htm
にも紹介されてました。
「HSP90βはRapsynのturnoverを制御し、結果的にAChR cluster形成・維持も制御する」
αBTX pull down、MS解析→HSP90βがとれた
HSP90βはAChR clusterとcolocalize
HSP90β-Rapsyn-AChRaが結合
阻害剤、miRNA、dominant negativeでcluster減少（vitro, vivo)
CHX（シクロヘキシミド）投与下で阻害剤投与→rapsynが時間依存的に減少。
助教はNeuron1999？ふるい論文
NMJの維持にはBDNF-TrkBシグナルが効いている
TrkBには細胞外領域だけのsplice variantあり。SVはシグナリングに関与しない
免染→FLはclusterときっちり共存、SVは若干もやもや
SVをvirus infectionで筋肉に導入するとdominant negative効果→AChR clusterの「つぶつぶ」が増える
TrkB +/-マウスでも同様の所見。
読み会
くそ忙しい
JN 2003
BMP→Smad1シグナルが出生時の小脳の発達に関わる。
小脳由来細胞にBMP投与でSmad1が核に移行、MAP&Synaptotagmin上昇→synaptogenesis?
Mくん
Wnt→βcateninシグナリングに関わる新規分子の探索
JN 2003
BMP→Smad1シグナルが出生時の小脳の発達に関わる。
小脳由来細胞にBMP投与でSmad1が核に移行、MAP&Synaptotagmin上昇→synaptogenesis?
Mくん
Wnt→βcateninシグナリングに関わる新規分子の探索
読み会
今日は日本に帰ってきたMくんを交えて、ひさしぶりに３人で。
助教はWntによるunplugged/MuSKシグナリング Neuronから
MuSK=unplugged (zebrafish)
unplugged mutant (unp/unp)でAChRクラスター形成が起きない＆motor neuronの走行もおかしい。
unpluggedにはsplice variantがあって、発生初期におけるAChRクラスターの形成に関わる。
MuSKは広義にWnt receptor familyに属している→リガンドとなるWntの探索→Wnt11（？）
Wnt11がMuSKに直接結合し、dishevelledの下流が流れる。
あとincucibleなknock-in実験→SV (splice variant)を初期に発現させるとunp/unp phenotypeはやや改善、FLを初期に発現させても改善されない？
自分はrapsynとCalpainがAChRクラスター形成に果たす役割 Nueron 55, 247-260
Cholinergicな刺激でAChRクラスターは分散する（既報）
→+calpeptin (calpain inhibitor)で分散防ぐ→分散はcalpain依存的
rapsynはcalpainと結合し、calpain抑制→p25産生抑制
agrinをかけることでrapsynとcalpainの結合促進、結果calpain抑制 (vitro, vivo)
agrin-/-のAChR cluster分散をcalpastatin tg mouseとの交配によりややrescue。ただしaneural clusterは残る→pre側のdifferentiationは改善されなかった
助教はWntによるunplugged/MuSKシグナリング Neuronから
MuSK=unplugged (zebrafish)
unplugged mutant (unp/unp)でAChRクラスター形成が起きない＆motor neuronの走行もおかしい。
unpluggedにはsplice variantがあって、発生初期におけるAChRクラスターの形成に関わる。
MuSKは広義にWnt receptor familyに属している→リガンドとなるWntの探索→Wnt11（？）
Wnt11がMuSKに直接結合し、dishevelledの下流が流れる。
あとincucibleなknock-in実験→SV (splice variant)を初期に発現させるとunp/unp phenotypeはやや改善、FLを初期に発現させても改善されない？
自分はrapsynとCalpainがAChRクラスター形成に果たす役割 Nueron 55, 247-260
Cholinergicな刺激でAChRクラスターは分散する（既報）
→+calpeptin (calpain inhibitor)で分散防ぐ→分散はcalpain依存的
rapsynはcalpainと結合し、calpain抑制→p25産生抑制
agrinをかけることでrapsynとcalpainの結合促進、結果calpain抑制 (vitro, vivo)
agrin-/-のAChR cluster分散をcalpastatin tg mouseとの交配によりややrescue。ただしaneural clusterは残る→pre側のdifferentiationは改善されなかった
つかれた
午後までバイト。
研究室に帰ってきて、桜の下でホームページ用の集合写真を撮りました。
なので近々更新されると思います。
そのあとセミナー。３時間は長かった。
なんだかんだで２３時。なぜ？
きょうはMyoDノックアウトマウスについての論文 JN 2006?
MyoDは筋肉の分化に非常に重要だが、ノックアウトマウスは死なない（身体が多少ちいさいらしいが）。
ただ、AChR clusterは散らばって存在、motor axonのmain trunkが見当たらない。
e14.5では同程度のendplate bandの幅に差なし（innervateされなさ具合も同等)
→e16になるとendplate bandの幅のみ拡大。innervation度は同等。
筋肉培養細胞で、agrinに対する反応も同じくらい。denervationに対する応答も正常。
ただ、AChRγ→εへの遷移に遅延（WB、免疫染色）。
adultでもAChR clusterの形が貧弱。
これだけだといろいろ解釈できるので困ってしまうんですが、MyoDとMyf5のダブルノックアウトで
NTF分泌されず→e13.5でMNの過剰なアポトーシス→→胎生致死というストーリーができてるっぽい。
MyoDだけのノックアウトだとMyf5がカバーしてくれるので致死は免れる、という見方が強い。
研究室に帰ってきて、桜の下でホームページ用の集合写真を撮りました。
なので近々更新されると思います。
そのあとセミナー。３時間は長かった。
なんだかんだで２３時。なぜ？
きょうはMyoDノックアウトマウスについての論文 JN 2006?
MyoDは筋肉の分化に非常に重要だが、ノックアウトマウスは死なない（身体が多少ちいさいらしいが）。
ただ、AChR clusterは散らばって存在、motor axonのmain trunkが見当たらない。
e14.5では同程度のendplate bandの幅に差なし（innervateされなさ具合も同等)
→e16になるとendplate bandの幅のみ拡大。innervation度は同等。
筋肉培養細胞で、agrinに対する反応も同じくらい。denervationに対する応答も正常。
ただ、AChRγ→εへの遷移に遅延（WB、免疫染色）。
adultでもAChR clusterの形が貧弱。
これだけだといろいろ解釈できるので困ってしまうんですが、MyoDとMyf5のダブルノックアウトで
NTF分泌されず→e13.5でMNの過剰なアポトーシス→→胎生致死というストーリーができてるっぽい。
MyoDだけのノックアウトだとMyf5がカバーしてくれるので致死は免れる、という見方が強い。
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